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ELISA固體樣本處理的方法有哪些?
更新時間:2025-06-25瀏覽:163次

  標(biāo)簽:Elisa 抗體 標(biāo)準(zhǔn)品 緩沖液 本生試劑盒 裂解液 蛋白酶

  

  在ELISA檢測中,固體樣本(如組織、糞便、植物、食品等)需要經(jīng)過適當(dāng)處理,以釋放目標(biāo)分子(如蛋白質(zhì)、抗原或抗體)并消除干擾物質(zhì)。以下是 固體樣本處理的常用方法及步驟:

  一、固體樣本處理通用流程

  1. 樣本收集與保存

  快速處理:避免樣本降解(如組織樣本離體后盡快冷凍或液氮保存)。

  儲存條件:-80℃長期保存,避免反復(fù)凍融。

  2. 樣本均質(zhì)化

  通過物理或化學(xué)方法破碎細胞/組織,釋放目標(biāo)分子:

  機械破碎:

  液氮研磨(適用于組織、植物)

  勻漿器/超聲破碎(適用于軟組織、細菌)

  珠磨法(適用于堅硬樣本如種子、糞便)

  酶解法:

  使用蛋白酶K、溶菌酶等(適用于微生物或含細胞壁的樣本)。


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  3. 裂解緩沖液選擇

  根據(jù)目標(biāo)分子性質(zhì)選擇裂解液:

  RIPA緩沖液(通用型,含去垢劑如Triton X-100、SDS)

  PBS/TBS緩沖液(溫和裂解,適用于可溶性蛋白)

  特殊緩沖液:

  含EDTA(抑制金屬蛋白酶)

  含蛋白酶抑制劑(防止蛋白降解)

  4. 離心去雜質(zhì)

  低溫離心(4℃,10,000–15,000 ×g,10–15分鐘)去除細胞碎片、不溶物。

  取上清用于ELISA檢測(避免吸取沉淀)。

  5. 蛋白濃度測定與標(biāo)準(zhǔn)化

  用BCA/Bradford法測定總蛋白濃度,調(diào)整至統(tǒng)一濃度(如1–2 mg/mL),避免檢測偏差。

  6. 干擾物去除(可選)

  脂質(zhì)干擾:有機溶劑(如丙酮)沉淀或脂質(zhì)吸附劑處理。

  多糖/酚類干擾(植物樣本):PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)吸附。

  內(nèi)源性酶干擾:加熱滅活或添加抑制劑(如HRP樣本避免辣根過氧化物酶干擾)。

  二、常見固體樣本處理示例

  1. 動物組織(如肝臟、腫瘤)

  步驟:

  液氮速凍,研磨成粉末。

  加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30分鐘。

  離心取上清,測定蛋白濃度后稀釋至相同濃度。

  2. 植物葉片

  步驟:

  液氮研磨后,加入PVP(去除多酚)和Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)。

  離心后取上清,必要時透析去除色素。

  3. 糞便樣本

  步驟:

  懸浮于PBS(如1:10 w/v),渦旋混勻。

  離心去除大顆粒,上清過濾(0.22 μm)或進一步純化(如PEG沉淀病毒)。

  4. 食品(如肉類、谷物)

  步驟:

  均質(zhì)化后,用PBS或?qū)S锰崛【彌_液(如食品過敏原檢測試劑盒配套緩沖液)提取。

  離心后取上清,必要時脫脂(正己烷洗滌)。

  三、注意事項

  避免過度裂解:可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白降解或非特異性結(jié)合。

  對照設(shè)置:

  陰性對照:裂解緩沖液空白。

  陽性對照:已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

  樣本稀釋:若信號過強,需用裂解緩沖液稀釋后重測。

  批次一致性:同一實驗使用相同處理條件的樣本。

  四、優(yōu)化方向

  預(yù)實驗:測試不同裂解液和離心條件,選擇最佳回收率。

  試劑盒兼容性:某些ELISA試劑盒提供專用樣本處理緩沖液(如糞便DNA/RNA保存液)。

  通過規(guī)范化的固體樣本處理,可顯著提高ELISA檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性!

  注:以上資料僅供參考,具體請咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商。

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