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ELISA實驗：標準品稀釋步驟指南
本生(BUNSEN)為您詳細講解ELISA實驗中稀釋標準品的關鍵步驟和注意事項。這是實驗成功與否的基石，精確的稀釋決定了標準曲線的質量，從而直接影響最終結果的準確性。
一、核心原則
標準品稀釋的目的是創(chuàng)建一系列已知濃度的標準點，用以繪制標準曲線(通常為S型或線性化后的直線)。未知樣本的濃度將通過此曲線計算得出。因此，稀釋的精確性和一致性至關重要。
二、實驗前準備
試劑與材料：
標準品凍干粉:從冰箱中取出，室溫靜置15-20分鐘平衡至室溫。
標準品/樣本稀釋液:務必使用試劑盒指定的專用稀釋液。不同的檢測目標(細胞因子、激素等)可能需要不同的基質(如血清、血漿模擬液)，以避免干擾。
去離子水或超純水：用于復溶凍干粉。
無菌離心管(1.5mL EP管)、試管或細胞培養(yǎng)板(用于系列稀釋)。
精確的可調移液器(如P1000, P200, P20)及匹配的、潔凈的低吸附吸頭。
渦旋混合器 和 小型離心機。
說明書：
仔細閱讀試劑盒說明書，確認標準品的初始濃度(如 1000 pg/mL)和需要復溶的體積(如 500 μL)。
確認說明書建議的標準曲線濃度范圍(如 7.8 pg/mL - 500 pg/mL)和稀釋倍數(shù)。常見的梯度是倍比稀釋(Serial Dilution)。
三、操作步驟
第一步：復溶
離心：將標準品凍干粉管短暫離心(如 3000 rpm, 1分鐘)，使粉末集中到管底，避免開蓋時損失。
加液：加入說明書指定體積的去離子水或指定的復溶液。
混勻：輕輕渦旋(避免產(chǎn)生過多氣泡)或上下吹打至少1分鐘，確保粉末溶解。切勿劇烈振蕩。
靜置：室溫靜置10分鐘，使其充分水化。此時溶液的濃度即為最高濃度儲備液(Stock Solution)。
第二步：配制最高濃度點
取一個潔凈試管，加入一定體積的稀釋液(例如 900 μL)。
吸取一定體積的復溶后的標準品儲備液(例如 100 μL)加入稀釋液中。
輕輕渦旋或吹打混勻。此管濃度即為標準曲線的最高濃度點(例如，1000 pg/mL儲備液稀釋10倍，得到 100 pg/mL的最高點)。
示例：若儲備液為1000 pg/mL，要配制500 pg/mL的最高點，可采取1:1稀釋(如500μL儲備液 + 500μL稀釋液)。
第三步：系列倍比稀釋
這是最關鍵的一步。以制備7個濃度點為例(從最高濃度點開始稀釋)：
取7-8個排在一起的試管或孔板，除第一管外，每管加入等體積的稀釋液(例如 300 μL)。
第1管：加入與稀釋液等體積的“最高濃度點"溶液(例如 300 μL)，此時第1管濃度即為最高濃度(如 100 pg/mL)。
第2管：從第1管中吸取等體積液體(例如 300 μL)，移至第2管中。輕輕吹打或渦旋混勻。
后續(xù)管：重復此過程：從第2管取 300 μL 加入第3管，混勻;從第3管取 300 μL 加入第4管，混勻……直至稀釋到最后一管。
最后一管：從最后一管(濃度點)中吸取 300 μL 液體并棄去，以保證所有管的體積一致。
四、關鍵注意事項(本生提醒您)
低溫操作：對于非常不穩(wěn)定的蛋白，整個稀釋過程請在冰上進行，并使用預冷的稀釋液和器具。
避免吸附：使用低吸附的移液器吸頭和試管，以減少蛋白在管壁上的損失，這對于低濃度點尤其重要。
充分混勻：每一次轉移后都必須充分混勻，這是保證梯度準確性的關鍵。但需避免產(chǎn)生氣泡。
更換吸頭!每一步稀釋都必須使用新的無菌吸頭，否則會污染后續(xù)所有濃度，導致實驗失敗。
及時使用：稀釋好的標準品應盡快加入酶標板孔中，通常建議在30分鐘內使用。
設置復孔：加樣時，每個濃度點建議做2-3個復孔，以提高數(shù)據(jù)的可靠性。
通過遵循以上步驟，您將能制備出一條準確、可靠的標準曲線，為整個ELISA實驗的成功奠定堅實基礎。
注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產(chǎn)品說明請咨詢技術老師或品牌供應商。
ELISA試劑盒 本生一直視質量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。本生試劑盒
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